临床应用

无创产前检测的现状与前景

字号+ 作者:澳门正规博彩50大网站|澳门正规网上真人博彩|澳门娱乐场排行榜网站 来源:未知 2019-04-25 14:38 我要评论( )

基于母体外周血胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)和高通量测序(Next-generation Sequencing,N

无创产前检测的现状与前景

 

 

 

基于母体外周血胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)和高通量测序(Next-generation Sequencing,NGS)等技术的无创产前检测(Non-invasive prenatal testing,NIPT)正成为目前应用最为广泛的临床高通量基因检测技术应用。继1997年发现孕妇外周血中存在cffDNA后[1],香港中文大学的卢煜明(Dennis YM LO)教授团队在2008年提出了应用NGS对cffDNA进行检测从而评估唐氏综合征风险的方法[2],即NIPT。自此至今的十多年里,NIPT逐步得到了临床上的验证和技术上的发展。本文将从多个维度来介绍和剖析NIPT技术发展的现状,并思考和评估NIPT技术发展的前景。

本文将从三个角度剖析NIPT产业的发展方向,包括:(A)技术研发;(B)应用发展趋势;(C)临床科研合作。

NIPT的技术研发

NIPT的技术研发,首先要基于对应的技术平台。目前主流的NIPT是基于NGS技术的,主要分为illumina的基于可逆荧光终止子技术的测序平台以及thermofisher scientific的离子电压半导体技术的测序平台。前者的技术代表,在国内是以贝瑞和康的贝比安为主,国外有illumina的Verifi(收购自Verinata)[3]、natera的Panorama[4]和Sequenom(现Integratedgenetics)的MaterniT21 PLUS[5];后者的技术代表,在国内是达安基因(达瑞健康)的无创产前检测、博奥检验的诺儿康[6],国外有PremaItha的IONA[7]等。除此之外,华大的NIFTY[8]和NIFTY全因可基于多个NGS平台,包括基于原CG(Complete Genomics)的高通量三代测序平台,而国内还有天昊诊断的基于毛细管电泳的一代测序平台的NIPT技术,在国外有Roche旗下Ariosa为避免专利问题而重新研发的基于微阵列芯片技术进行DNA捕获的Harmony[9]。不同的技术平台,其NIPT的技术研发思路和发展前景是截然不同的。

基于NGS的NIPT技术研发

主流的基于NGS的NIPT技术研发,基本原理在于分析cffDNA的拷贝数变异(CNV)。最初Dennis LO团队在检测胎儿21号染色体三体时采用的是read count的CNV分析辅以Z-test作为显著性差异检验[2],后续在13/18号染色体三体的研究中增加了对GC含量进行read count校正的方法[10]。这种Z-test属于baseline Z-test,即与阴性样本参考库的分布进行比较,这个阴性样本read count均值即为baseline value。实际上根据这个参考值的不同,可以有多种Z-test。华大的张秀清等人提出了以样本自身内部长度接近的染色体read count值作为参考值进行Z-test[11],即internal chromosome。达瑞健康的NIPT则采用了以样本自身中值作为参考值,再与阴性样本参考库进行比较。上述3种Z-test都是常规的NIPT算法基础,目前市场上绝大多数的胎儿染色体非整倍体检测的NIPT产品都是在这个算法基础上进行完善。另一NIPT始创团队Stephen Quake在当时采用的是相关性分析和T检验[12]。

 

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图1 基于read count的NGS NIPT的方法原理[2]

华大的NIFTY文章中,除了对阴性样本参考库的比较外,增加了对该样本可能存在的阳性情况的比较,即加入了对胎儿比例的考虑,并将两者的Z值相除得到L值,对L值进行T分布检验来判断结果[8]。这个考虑了胎儿比例和阳性情况的算法有助于提升NIPT的准确性。另外有欧洲的研究团队提出了对Z值再进行Z检验得到ZZ值,并同时采用Z值和ZZ值进行分类比较,来降低假阴性和假阳性[13]的发生。但这种方法在判定上过于累赘,而且受阴性样本库质量的影响。达安临检最近发表的文章中,提出了使用支持向量机(SVM)辅助NIPT判定的方法,通过对上述3种Z检验在阴性和阳性预测上的6种Z值结果,加上样本的临床指征作为机器学习的参数,训练出SVM模型来进行判定,有效提升准确率的同时降低约3%的灰区重测成本[14]。使用机器学习算法和人工智能深度分析,有望成为未来1-3年内提升NIPT准确性的发展方向。

对于基于read count的NGS NIPT技术,在实验环节上无论是illumina还是ion torrent平台,PCR扩增都是一个影响DNA真实拷贝数的环节。贝瑞及其合作者提出的环化单分子重测序技术cSMART[15]预期可消除这一环节引起的偏差,有助于在相对低的测序通量下获得稳定的真实信号。其实任何NGS技术的研发和应用,实验和计算都是紧密相关的。因此,不同的NIPT厂商必须要根据其NGS平台进行技术上的优化,这既可以是计算上的也可以是实验上的。

 

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图2 基于size count 的NGS NIPT的方法原理[16]

Dennis LO团队在研究中发现游离的胎儿DNA长度比游离的母体DNA长度要显著短,因此通过对cfDNA的序列长度size进行统计,并与阴性样本参考库的对应值进行比较,即可进行染色体非整倍体的判定[17]。该团队后续还研发出相关的程序来进行计算[18],并以此基础,开发出无需阴性样本参考库,即control-free的方法[16]。这种基于cfDNA size的NIPT,比较有效地降低了由于cffDNA的不足所造成的假阴性的问题。不过,cfDNA长度的计算依赖于测序方法本身:在illumina平台上,需要进行双端(Paired-end)的测序才能得到DNA片段长度的信息,而这个在一般NIPT产品如贝瑞的贝比安里是缺乏的;而在ion torrent平台,很神奇的是,尽管也是单端(Single-end)测序,但300个循环(flow)里总能满足cfDNA全长约150bp的测序,因此ion torrent平台能满足cfDNA长度需求的同时节省测序的成本和时间。目前基于size count的NGS NIPT技术研发好像只有Dennis LO团队在做,算法可被直接用于illumina平台的NIPT厂商的产品,然而ion torrent平台的NIPT产品应该同样可以适用。基于size count的NGS NIPT在计算量上比基于read count的NGS NIPT要少很多,对计算资源来说是一个优势,但准确性仍需进行大样本的分析。

其他NIPT技术研发

如果单单从检测21三体的角度出发,NIPT本身其实不需要用到NGS技术。Dennis LO团队最初也提出过使用数字PCR(Digital PCR)来进行21三体的检测[19, 20]。与数字PCR这种基于探针杂交的检测技术类似,微阵列芯片也是可用于NIPT的技术。Roche旗下的Ariosa,最初也是使用illumina平台,并通过DANSR array的芯片技术来进行DNA捕获和建库[9, 21],缩减测序通量和提升信号的稳定性。受困于NIPT方法专利上的问题,后来Ariosa直接使用微阵列芯片来进行NIPT检测,并指出芯片NIPT比基于NGS的NIPT有更高的稳定性[22]。

基于探针杂交技术的NIPT在计算上的资源消耗远低于NGS NIPT,这是因为NGS NIPT需要对高通量测序数据进行比对分析,不光数据量巨大(GB级别)而且计算量也不是普通PC可以承受,但一般这个比对分析的计算资源可由测序仪厂商提供配套的服务器来解决。而数字PCR或芯片NIPT能得到反映DNA相对定量的荧光值,可直接用于拷贝数分析,算法上类似基于read count的NGS NIPT。尽管在计算上拥有资源消耗低的优势,但随着NIPT性能逐渐强大,芯片NIPT在性能拓展上可能存在成本上的劣势。目前Ariosa的Harmony可以检测3种三体、性染色体非整倍体以及22q11.2微缺失,暂时未知后续功能增加的研究方向。自NGS技术开发以来,高通量测序的成本日益下降,但芯片方面的成本却下降缓慢。虽然NGS方面在建库的成本上一时间很难大幅降低,但在测序环节上成本是逐年下降,换而言之,同样的测序成本在未来可以承担更高通量的测序,为NGS NIPT提供更好的性能;而基于芯片的NIPT,在拓展性能的技术研发上可能需要成倍的增加成本(探针数的增加和微阵列的重新设计),成本的维持或降低需依赖于芯片技术的更新换代。

基于一代测序的NIPT属于小众的技术,国内目前已知是天昊诊断(genesky)在做,但暂时应该还没有CFDA认证的仪器和体外诊断试剂,因此即使有NIPT产品也只能发科研报告。天昊这款基于毛细管电泳测序技术的NIPT产品叫NiPS,通过对多个特定位点设计扩增(Multiplex amplification)和测序引物,并从一代测序结果的峰值图中从多态性位点解析出胎儿染色体拷贝数,从而推算染色体非整倍体的结果[23]。类似芯片NIPT,一代测序NIPT在计算上消耗低,而且实验时间甚至比芯片NIPT更短(一代测序一般半小时内可完成)。同样,一代测序NIPT在性能拓展上也面临成本问题。目前天昊NiPS只针对常规3个染色体的检测,要实现NIPT-plus的功能,成本将成本提升,并大幅增加多重扩增的难度,而且thermofisher scientific的一代测序仪不比NGS任意平台的仪器便宜。

实验操作上的技术研发

上述4种NIPT技术的研发,除了生物信息学的算法支持外,实验中的技术研发也是不可缺少的。这主要体现在:(1)采血管的优化;(2)胎儿游离DNA的保留和富集;(3)测序建库或多重扩增的优化。

目前NIPT都是以外周血游离DNA为检测样本,因此外周血中游离DNA的质量是关键,而不同的采血管在保持血浆稳定性上有所不同,分别适用于长时间(Streck)或短时间(Ardent)保存,这与NIPT服务的运营方式有关。像华大这种以区域中心进行大规模样本处理的直营模式,血液样本或DNA样本需要经过一定时间的运输,则可能需要选择相对高价的Streck管;而像达瑞这种本地化小规模样本处理的代销模式,则可在当地NIPT实验室直接进行检测,Ardent管甚至普通的无DNA酶采血管即可。

胎儿游离DNA的富集则是目前NIPT实验技术研发的方向,同理也符合ctDNA检测的需求。目前cffDNA主要的研究方向分别是:磁珠特异性富集、设计独特的PCR方法和电泳胶回收[24]。博奥的磁珠法是目前被实践证明有效的富集cffDNA的方法[25],据其专利说明文档内容,该技术可将cffDNA浓度提高至20%-40%,这样可有效对cffDNA进行检测,降低假阳性和假阴性的概率,同时可以大幅减少高通量测序的数据量,降低测序成本。低温变性共扩增PCR(co-amplification at lower denatuation temperature PCR,COLD-PCR)被认为是有效手段之一[26];而反向PCR(inverse PCR)也具备一定潜力[27]。另外,吉林大学曾提出一个多步的PCR方法来富集长度上较短的胎儿游离DNA[28]。琼脂糖凝胶进行核酸分离和回收是一个比较直接的解决方案[29],这可能需要进行技术上的细化和自动化。Dennis LO团队也在这方面进行过其他尝试,即选取单链DNA文库进行扩增,虽然有效富集游离DNA的含量,但暂无法将胎儿从母体的游离DNA中进一步富集[30]。

测序建库的优化,主要体现在增加测序稳定性和降低成本上。前面提到,罗氏Ariosa原本也是基于illumina平台的,后来改为使用自家的微阵列芯片技术DANSR array进行NIPT中的DNA捕获和建库[9, 21],以降低测序的通量(仅1M左右的序列数)和提高DNA分布的稳定性。另外,上面提到的cSMART技术也是为了获得更稳定更真实的DNA分布数据。

NIPT的临床应用

NIPT应用于胎儿染色体异常筛查是开始自2014年相关试剂盒获批,2016年卫计委发布技术规范后已经逐渐成为了常用的产前筛查方法。一份NIPT报告究竟说了什么?目前还存在哪些内容是医患双方存在理解不一致的?如何理解NIPT的假阳性和假阴性?以下内容会进行解答。

NIPT的性能指标与能力范围

首先要明白如何解读一份NIPT的报告,即《孕妇外周血胎儿游离DNA产前检测临床报告单》。对于不了解NIPT技术原理和数据分析方法的普通患者乃至临床工作者来说,NIPT报告中的Z值基本上就等同于阴性和阳性结果的判定。对于染色体检测结果的Z值,从统计学定义上来说,一般是指是样本染色体拷贝数()与阴性数据库染色体拷贝数基线值()的差除以阴性数据库染色体拷贝数的标准差(s.d.)所得到的数值。约去后,可用变异系数CV替代s.d.值。

 

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实际上,如果假设阴性数据库染色体拷贝数基线值跟样本正常阴性状态的染色体拷贝数是一致的话,由于差值是样本胎儿DNA比例与阴性数据库的胎儿DNA比例的差值,即FF/2(FF指fetal fraction,除以2是指三倍体与二倍体的差距),可得:

 

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这也是阳性样本Z值期望值的公式[31]。一般阴性结果在-3到3之间,即NIPT报告中的参考范围,大于3是三体高风险信号。这里3作为Z值的判定阈值,是从统计学上定义的,即99.9%偏离正常预期。目前来说Z值的计算是NIPT分析的核心,但由于实验和分析方法的问题,会导致Z值出现不同情况的波动,影响最终的结果判定和相关性能指标。

根据2016年国家卫计委妇幼司发布的第45号文对NIPT检测质量的规范,性能指标里提到检出率(DR,detection rate)、假阳性率(FPR,false positive rate)和阳性预测值(PPV,positive predict value)。这需要通过统计学的四格表来理解:

表1 统计四格表

 

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一般不使用准确率的主要原因是,由于d数值很大,因此计算准确率(a+d)/(a+b+c+d)所得数值会达到99%以上。因为NIPT所检测的21三体、18三体和13三体,发病率都低于1/200,即使临床上全部发阴性结果,最终准确率也可以达到99%,所以准确率不适用于作为NIPT性能指标。而检出率,即DR = a / (a+c),指阳性结果里被检测到的概率。第45号文写明“21三体综合征检出率不低于95%,18三体综合征检出率不低于85%,13三体综合征检出率不低于70%”。以21三体唐氏综合征为例,20例唐氏儿漏检不超过1个才算合格。假阳性率,即FPR = b/(b+d),指阴性结果例被错误检测成阳性的概率。第45号文写明“21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征的复合假阳性率不高于0.5%”,即假设出具200例的NIPT阴性报告,不能有超过1个的阳性样本,无论是21、18还是13三体阳性。阳性预测值,即PPV = a/(a+b),指所出具为阳性的结果里,真阳性的比例。第45号文写明“21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征的复合阳性预测值不低于50%”,即所出具的NIPT阳性报告里,至少一半以上是真阳性。对假阳性率和阳性预测值的要求,规范里NIPT技术里对阳性检测的准确性。这也是NIPT优于血清学检测而有望取而代之的关键。两者对比,临床传统的血清学检测FPR高达5%,PPV只有2%,而一般NIPT企业的技术都能满足第45号文所规范的最低要求。

从上述内容可知,NIPT作为产前筛查的一种非入侵性手段,首先其检测对象就是3种三体综合征,而不包括其它染色体非整倍体和遗传病。诚然实际上NIPT是有这样的潜力来进行其它染色体非整倍体、微重复缺失、拷贝数变异以及相关的遗传病检测,但临床上对此有严格的限制。其实任何的基因检测也是同样的道理,不是技术先进就可以随意出具检测报告的,临床上对此有2大原则:

1、该检测相关的疾病机制明确,临床上具备相关处理方案。

2、检测的目标对象与相关疾病关系明确。

临床上进行NIPT,关键还是胎儿比例的检测成功率。一般《孕妇外周血胎儿游离DNA产前检测临床报告单》以及知情同意书,都会明确要求患者要符合与胎儿比例相关的各种限制条件。诸如异体输血、母体肿瘤、母体三体、多胞胎、肥胖等干扰性因素,其样本原则上将不被纳入检测。当然,技术上如有解决方案,上述问题的样本依然可以进行相关实验。

NIPT的假阳性与假阴性

随着NIPT的逐步推广,从指定的血清学高风险人群到现在有可能推广到普通筛查,每年进行NIPT的孕妇人数不断增多,同时也带来了很多之前技术和临床上没很好解决的问题,例如华大基因承认有70例漏检案例出生。但要明确的是,不能以有错误就全盘否定的思想来看待问题,NIPT即使技术上比血清学准确,但也从没被科学界认为是100%准确的金标准,更不是能检测所有问题的手段。目前NIPT只能取代传统血清学筛查,但仍无法动摇羊水穿刺作为产前诊断金标准的地位。事实上,正因为NIPT在假阳性上的表现差距,导致其仍无法取代入侵性的产前诊断技术。

NIPT假阳性的原因有以下几个:

1、NIPT数据分析的波动。

上文提及的不同Z值计算公式中,对分析结果会有不同的影响,更不用说不同NIPT企业所使用的阴性数据库的差异。如图3所示,按阴性和阳性样本所得Z值的分布,会有一定概率出现阴性样本Z值大于3,或阳性样本Z值小于3。事实上,即使按照最普通的阳性样本Z值期望值公式Z=FF/2/CV,也能揭示为何Z值的计算往往已决定了假阳性的必然存在。以21号染色体为例,如果CV约等于0.67%,胎儿比例是理想状态的10%,则Z值的期望值是10,Z值分布就是以10为中心的正态分布,其中Z在3~5区间分布的概率约为10%。如果21号三体的发病率是1/200,那么21号三体在NIPT中胎儿比例10%所得Z值在3~5的概率约是1/2000,即这种情况下真阳性约为1/2000,而按Z本身的统计定义,Z值大于3时约有1/1000的概率属假阳性,则Z值在3~5区间时,阳性预测值PPV约为33%。这意味着Z值的实际大小对样本判定极为重要,尤其是在Z刚好大于3的区间内,样本的判定不能仅凭Z值本身,而亟需进行优化。而且,胎儿比例FF在很大程度上决定了Z值的大小,但FF小于10%时,PPV会变得更小,NIPT的准确性进一步下降。

 

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图3 NIPT中阴性和阳性样本的Z值分布[14]

 

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图4 在不同的变异系数下,胎儿比例和阳性预测值之间的关系[31]

胎儿比例是Z值计算的一个极其关键的参数。虽然不少文献[8]曾指出过,在低胎儿比例的情况下依然能检出阳性样本,但“能检出”与符合性能要求是两回事。一般来说,胎儿比例小于8%的话性能指标就会下降不少[32],存在不少假阳性以及假阴性的情况。在上文中关于技术研发的内容里有提到从生信分析中提高准确性,以及优化实验流程管理来控制环境因素的阴性。而实验中提高胎儿比例是个有效的解决方法,提高一倍的胎儿比例可等价于有效测序数据量降低到1/4。在这方面,博奥的磁珠法[25]是目前相对较好的解决方案。

2、母体染色体非整倍体和拷贝数变异影响。

母体染色体非整倍体和拷贝数变异,同样会造成NIPT假阳性的结果。实际上这种假阳性在原理上是可以过滤掉的,因为cfDNA中有90%都是来自于母体的,如果是受母体染色体非整倍体和拷贝数变异的影响,所得到的阳性信号会比惯常出现的NIPT假阳性结果要大几十倍。这里要指出的是,拷贝数变异(CNV)也属于一种多态性标记,并不一定是致病性的。不同的人会存在各自的germline CNV(生殖细胞系拷贝数变异)[33, 34],这可用于遗传分析和日后的疾病风险评估,但目前临床上在缺乏相关疾病原理和诊断标准的情况下,不应作为NIPT的报告结果内容。

3、胎盘特异性嵌合体(CPM,confined placental mosaicism)。

上述提到的两种假阳性,都是可以通过技术优化来避免和过滤的,但由胎盘特异性嵌合体[35, 36]造成的NIPT假阳性,则是NIPT方法自身无法解决的。这是因为,cfDNA检测的DNA片段来自胎盘绒毛外层的滋养层细胞,一般来说这些胎盘细胞的基因组应该跟胎儿是一致的,但实际上有发现大概存在2%是胎盘特异性嵌合体,造成胎盘染色体核型与胎儿染色体核型不一致的情况。CPM引起的假阳性,指的是胎盘染色体是阳性但胎儿是正常的情况。同理,CPM也会造成假阴性的结果。这种CPM造成的NIPT错误也是NIPT只能用于筛查而非诊断的关键因素。

性能指标将更多的重点放在里阳性结果的有效预测中,但对于临床来说,阴性报告的可靠性同样重要。NIPT发明的意义,在于大幅缩减进行入侵性羊水穿刺的案例,避免因为入侵性检测(约0.4%概率)造成的流产。传统的血清学筛查就是在羊水穿刺等入侵性产前检测前进行的筛查,但众所周知其准确率无法令人满意。而NIPT可以对高风险人群进行高度准确的筛查,有效减少进行入侵性产前诊断的人数。这个有效性的前提是,NIPT的阴性结果必须是可靠的。一般发生NIPT阳性报告,后续会经历重测确认(包括可能的重采血)、羊水穿刺确诊等多重手段来确认结果,但阴性报告则会视为是“安全”的而缺乏针对性的确诊流程。因此,要让NIPT履行其使命,阴性报告必须是严谨且可靠的,假阴性要尽可能地被排除。

性能指标上一般用假阴性率(FNR,false negative rate)来衡量一个技术。FNR是指1-DR(检出率),即FNR = c/(a+c),所有阳性样本里被错误诊断为阴性的概率。因此,要让FNR=0%,实际上DR要做到100%。除了因为统计算法如Z值的计算问题造成假阴性,另外就是上述提到的CPM也会造成假阴性。因此,理论上要完全避免假阴性是不可能的,但致力于尽可能消除假阴性,是每一个NIPT研发企业和产前诊断工作者的使命。通过有效的NIPT流程管理、算法和实验技术优化以及孕期各指标的全流程监控,是限制假阴性发生的重要环节。

NIPT的临床共识

高通量基因检测技术兴起至今不超过20年,其中各种应用在临床上依然处于摸索的状态。NIPT作为当今世界应用最广的高通量基因检测技术,世界上对其临床应用的共识一直是不断开放、不断细化、不断调整。

作为产前筛查的技术,NIPT自诞生之日前,就不断被拿来跟传统血清学检测和产前诊断金标准羊水穿刺进行比较。不仅如此,由于主流NIPT采用的是NGS技术,其高分辨率检测带来的不只是唐氏综合征的结果,还有其它染色体以及大量遗传病相关或未知的基因组变异信息。国内外医学组织一直对NIPT相关的技术进展、临床试验以及流程控制等进行研究,对NIPT及其拓展技术进行规范和引导,促进NIPT的临床应用和避免过度使用。

2011年,ISPD(International Society for Prenatal Diagnosis,国际产前诊断社区)发布了应用多并行测序法(MPS)进行唐氏综合征的产前检测的快速回应声明[37],主要内容是:(1)基于MPS的NIPT(简称MPS-NIPT,即NGS的NIPT)需要提供更多的临床试验证据,包括在低风险人群中的有效性、不同亚人群中的适用性(例如双/多胞胎,IVF捐赠者妊娠)、性价比和时效、以及联合其他方法进行筛查的可能办法;(2)暂定面向已进行其他筛查方法后得出高风险的孕妇,同时检测前需要进行适当的遗传咨询,包括对孕妇解释NIPT的好处和限制(并非所有唐氏综合征适用、假阳性的可能)、阳性结果后续会进行羊水穿刺或绒毛膜绒毛样检(CVS)来确认;(3)只限于唐氏综合征(21号三体)。该文代表作者是P. Penn (Natera), A. Borrel (Sequenom), H. Cuckle (PerkinElmer, Ariosa, Natera), S. Gross (Natera), Y. Yaron (illumina's Verifi, Fugene Genetics, Ariosa's Harmony),都是来自国外大型生物技术研发企业。

这是美国首个关于NIPT临床应用规范的权威声明,主要是对美国产前诊断领域应用NIPT技术进行初步指引。在这个阶段,NIPT仍需更多临床试验证据支持,平台也仅限于MPS(即NGS),应用范围也限定在21三体检测,作为血清学筛查和超声等方法的补充手段,同时强调了遗传咨询的必要性。

2012年,ACOG(American College of Obstetricians and Gyencologists, 美国产科及妇科学院)发布了第一个关于NIPT的委员会意见[38],内容包括:(1)NIPT可提供给35岁以上的孕妇,检测胎儿染色体非整倍体;受众是超声检测提示非整倍体高风险的人群、有三体孕史的人群、血清学检测阳性的人群、罗伯逊易位导致13或21三体高风险的人群;(2)试前需进行咨询,明确NIPT的功能范围和限制;(3)NIPT暂时不应成为产前常规检测,血清学或超声检测结果低风险的人群暂不适用;(4)NIPT结果阳性的,需进行后续的羊水穿刺或CVS确诊。

这是美国首个关于NIPT临床应用的团体意见,代表了美国妇产科专业对NIPT临床应用的指引。比ISPD在2011年的声明更进一步的是,允许了增加13三体的检测,细化了受众范围。

2013年,ACMG(American College of Medical Genetics and Genomics, 美国医学遗传学及基因组学学院)联合SMFM(Society for Maternal Fetal Medicine,母胎医学社区)发布了对NIPT的政策声明[39],内容包括:(1)建议NIPT服务商严格提供更多的临床参数,包括阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV);(2)NIPT存在限制:无法区分非整倍体的具体形式,如21三体或罗伯逊易位或嵌合体;不筛查单基因突变;不筛查神经管缺陷;并不能取代首月期的超声检测;(3)试前和试后咨询是必须的。

这是美国首个关于NIPT临床应用的政策声明,意味着美国方面将通过政策来规范NIPT技术的使用。该声明指出了NIPT性能参数的重要性,首次提出阴性预测值NPV也是重要的指标,同时强调了NIPT的各种限制,并提出了试后的遗传咨询建议。

2013年,NSGC(National Society of Genetic Counselors, 美国遗传咨询社区)对NIPT进行了讨论[40],观点如下:(1)认同NIPT是孕期胎儿染色体非整倍体评估的可选方法,但由于假阳性的存在,不能是诊断性的;(2)暂不支持NIPT作为血清学检测低风险人群的常规非整倍体检测方法;需更多证据支持;(3)MPS的NIPT有效检测21三体、18三体、13三体和X单体,DANSR的NIPT有效检测21三体、18三体和13三体;但NIPT仍不足以证明能检测其它染色体非整倍体和单基因病;建议试做前咨询,包括目标检测的疾病、功能限制及其作用条件、和尚未证实的功能范围;(4)NIPT需进行试前和试后的咨询。

这个文件从临床的角度明确了NIPT是胎儿染色体非整倍体的评估方法但由于假阳性而无法定性为诊断方法,同时限定了高通量测序平台与芯片平台的检测范围,拓展了18三体与X单体的检测,并明确指出了NIPT暂不足以支持其它染色体非整倍体和单基因病检测。

2013年,ISPD发布了染色体非整倍体筛查的正式立场声明(并于2015年进行了修订)[41],主要内容是:(1)总结了多个MPS平台(s-MPS,t-MPS,SNP)的NIPT试验结果(T21,T18,T13和X单体)以及不同生理指标所对应的唐氏综合征检出率等数据;(2)cfDNA的筛查可提供给所有孕妇,尤其是血清学和超声诊断为高危的人群,同时适用于常规产检里被诊断为中危的人群;对于没被提供cfDNA筛查的人群,超声神经管(NT)测试和血清学标记的联合测试(combined test)必须使用;而进行cfDNA筛查后,不需要再进行常规测试;(3)胎儿染色体非整倍体的确诊必须只能通过羊水穿刺或CVS;(4)孕周不能单独用于非整倍体风险评估;神经管测试不能作为单一测试进行(需联合血清学等方法);(5)当cfDNA筛查范围被延伸至MD/MP(微缺失/重复)和罕见三体,必须是针对临床上明确的疾病或清晰的重要诊断条件,必须具备明确的检出率(DR)、假阳性率(FPR)和阳性结果相关的临床描述信息。

相比起2011的快速声明,ISPD这份正式立场声明对NIPT技术本身及其应用范围进行细致的描述和界定。声明首次提出了多种NIPT平台都需要给出指定的性能指标并以此作为规范,同时首次提出了NIPT可用于普筛,并明确了进行NIPT后无需再进行血清学检测,以免浪费资源;另外,声明提出了可延伸至其它临床上明确的因微重复缺失或三体导致的疾病。

2016年,ACMG更新了对NIPT的政策声明,内容包括:(1)明确了NIPT是传统非整倍体筛查技术的可选替代方法中灵敏度最高的一个;允许患者选择诊断性的检测还是筛查性的检测;当NIPT报告阳性时要提供诊断性的检测(即羊水穿刺或CVS);(2)要提供准确、公平、更新的咨询给被诊断为胎儿染色体变异的患者,并提供对应的医学和心理学支持;(3)要提供可读的、清晰注明参数(检出率、特异性、PPV、NPV等)的试前和试后咨询,方便患者进行决策;如缺乏相关技术参数,则不能提供指定的三体检测服务;(4)不建议NIPT用于除了13、18和21三体之外的常染色体非整倍体检测;可扩展X染色体非整倍体检测,但相关参数必须清晰注明,做好试前和试后咨询,并需向患者明确指出X染色体非整倍体的检测涉及性别鉴定的信息;同理,要对阳性报告提供诊断性检测;(5)各NIPT实验室应对胎儿比例的分析和验证进行监控;如果胎儿比例不足导致NIPT报告失败,则直接提供诊断性的检测,无需再次抽血进行NIPT;如因肥胖问题,可提供其它非整倍体筛查服务;各实验室应对NIPT报告失败提供解释;

ACMG政策声明的更新,提高了NIPT在临床应用上的地位,突出了其准确性上的优势,并可能替代诊断性检测,同时在遗传咨询中首次提出了心理学方面的支持。在性能指标方面,声明认同可拓展至其它X染色体非整倍检测,但不建议其它常染色体非整倍体检测;另外,首次强调了NIPT的关键参数胎儿比例的分析,并指出如果胎儿比例不足的情况下应直接进行入侵性诊断。

2018年,ISPD联合SMFM和PQF(Perinatal Quality Foundation,围产期质量基金会)发布了关于使用基因组测序进行胎儿诊断的联合立场声明,主要内容是:(1)鉴于基因组检测技术的迅速发展和相关使用在临床疾病诊断上的信息仍不完善和持续更新,相关技术的研发和使用,必须公开研究相关的科学、临床、伦理和社会问题以及研究院的背景;(2)产前测序检测技术依然不能用作诊断。产前测序检测目前可用作研究实验手册,具体案例在辅助临床诊断上仍需向遗传专家进行咨询来明确诊断结果,同时在结果呈现上要包含基因组测序结果、与产前的关系以及与产前显像和咨询方面的专业知识;(3)对胎儿的诊断性测序应针对家族性的三人小组分析来进行,相关遗传病应该明确具体基因型与表型之间的相关性;技术提供方应详细说明相关检测会对受试者产生的影响;试前教育、咨询、知情以及试后的咨询都是必需的,包括受试对象的个体化分析、遗传信息的解读和测试的时间问题等;(4)建议胎儿测序检测技术可对相关疾病进行研究,包括家族遗传史明确的而CMA等无法分析的疾病、已有技术无法验证的胎儿异常等;研究本身可结合其他检测技术的分析结果,例如流产物检测等;相关研究应建立有效的实验质控分析流程和对变异的注释;

ISPD的这份联合声明,在之前的NIPT声明的基础上,拓展至使用基因组测序进行胎儿诊断的范畴。这意味着NIPT已成为基因测序方法的代表被引入到临床产前诊断中,而以后的临床规范里,将对基因测序方法(而非NIPT)作为研究对象来指定性能指标和限制检测范围。该声明首次提出了基因组检测技术的研发和临床应用应具备各方面的条件和许可,同时明确产前测序技术不能用作诊断;另外,首次提出了诊断性测序要针对家族三人小组进行分析,并建议将胎儿测序检测技术拓展至其它检测方法无法验证的疾病类型。

NIPT的应用发展趋势

随着NIPT的技术逐步增强和完善,以及临床上的逐渐普及,NIPT的应用发展将面临以下几个趋势:(1)性能提升,面向不同需求的用户;(2)成本控制和自动化操作;(3)功能和检测手段的延伸。

性能提升和用户区分

NIPT作为产前筛查的临床应用,目的是为了降低畸形出生率,优生优育和降低社会负担。其中3个三体是比较重要的疾病。随着NIPT的技术研发逐渐深入,能检测更多染色体或基因遗传疾病的NIPT-plus成为未来主流的发展趋势。这是符合NIPT最初的愿景以及社会需求的。早在2014年国内NIPT进行规范化之前,国内不少大型企业如华大、贝瑞、博奥等早已为NIPT-plus进行研发布局。事实上这也是理所当然的,毕竟基于NGS的NIPT,既然能检测13、18、21三个染色体的三体,必然也能检测所有染色体的非整倍体乃至微重复缺失等信号。虽然政策上目前仍只有13、18和21三体是临床上批准的检测项目,但随着NIPT-plus的研发逐步成熟以及预防遗传病的有效性逐步得到临床认可,性能提升的NIPT-plus理应成为未来产前筛查的主流服务之一。目前国内外NIPT厂商的NIPT产品及其检测范围如下:

 

无创产前检测的现状与前景

 

 

 

除了对各种胎儿/新生儿遗传病的检测外,像华大等企业还增加对孕妇肿瘤风险的检测,这与ctDNA的检测技术研发逐步重合,从技术上来看,两者是十分接近的。

实际上,伴随着NIPT-plus的性能提升和检测范围增加,尽管测序成本正在下降,但总体而言检测成本必然是比已有的NIPT产品要高很多。不少厂家例如华大、贝瑞、illumina、Sequenom等,已同时推出两种或以上NIPT产品,迎合不同消费能力的用户群体。也有厂家如Ariosa、Natera等,选择对已有NIPT产品进行轻度升级,再计划推出其他基因遗传病检测产品面向高消费用户群体。

成本控制和自动化

NIPT的发展,离不开成本控制。这分为仪器试剂耗材的成本和人力成本两种。以NGS的NIPT为例,在测序仪、测序试剂耗材、建库试剂这3方面做好成本控制的话,将有助于NIPT厂家的业务推广和盈利提升。在测序成本方面,作为仪器生产厂家的illumina/贝瑞、达瑞和华大将拥有天然的上游成本优势;而从测序通量来看,部分厂家通过技术优化来缩减测序通量,如贝瑞的cSMART、Harmony的DANSR array等,也是有效降低测序成本的方法。同时也有不少试剂研发企业如联川、艾吉泰康等通过研发低成本的建库试剂,也是NIPT厂商可以合作的选择。

在人力成本日益上升的当下,自动化操作是未来的趋势。目前已有不少NGS实验室采用了机械臂等半自动实验技术来提升工作效率和降低人为因素对实验结果的影响。鉴于NIPT作为比较简单的NGS技术应用,未来实行全面的自动化是可以预期的,关键是自动化设备的成本和人力成本的比较。对区域中心作业型的NIPT直销厂商如华大来说,自动化的流水线可以是发展的方向;而对本地化作业型的NIPT分销厂商如贝瑞、达瑞来说,则是自动化的工作台。测序仪的桌面化和实验室的自动化,可有助于NGS技术在临床上的普及。

功能和手段的延伸

目前NIPT是针对孕产妇和胎儿的临床检测,实际上对cfDNA的检测也包含了ctDNA。对于高龄生产逐渐成为主流的今天,高龄产妇伴随出现孕期肿瘤等情况也是存在一定的概率。孕期肿瘤的检测可以成为NIPT技术的一个延伸。已有不少科研团队在对cfDNA及其甲基化进行分析时发现,cfDNA中的甲基化位点分布与肿瘤的来源有很高的相关性[42]。通过对NIPT技术的进一步开发,可将孕期肿瘤检测包含在NIPT的检测范围内。同理,其他的非肿瘤疾病也存在可以通过NIPT进行检测的可能。

另外,如上面提到,目前NIPT的检测对象是母体外周血中的游离DNA。实际上抽血不完全是非入侵性的(non-invasive),而是低入侵性(less-invasive)。人体其他体液,例如孕妇的尿液中,能否同样存在提示胎儿遗传信息的信号,可能是值得研究的方向。未来的NIPT可以将外周血的蛋白检测、其他体液的核酸和蛋白检测包括在内,对孕产妇和胎儿的临床指征进行全面的分子层面的检查。

NIPT相关的临床科研合作

目前NIPT作为临床上高通量基因检测技术中应用最为广泛的一种,在产前诊断方面正成为有效的研究手段。事实上,除了游离的DNA(cfDNA),RNA和DNA的甲基化等修饰都可以成为检测和研究的对象。Dennis LO团队在早期研究外周血游离核酸时就曾对游离RNA的染色体非整倍体检测进行过研究,并通过对PLAC4基因mRNA的检测实现了这一想法[43]。各NIPT研发企业与医院的临床诊断中心进行下述3个方面的科研合作:(1)遗传病检测;(2)发育异常监控;(3)免疫排斥预警。

遗传病检测

新生儿遗传病乃至罕见病的检测,是未来NIPT-plus的发展方向。NIPT厂商在研发过程中必须跟临床科室进行具体疾病的科研合作和临床试验,以获得必要的实验数据来完善实验和算法设计以及专利等申请。目前已有部分新生儿遗传病正进行临床研究。今年在上海举办的2018新生儿疾病筛查进展高峰论坛上,多种疾病被重点列出,如下:

 

无创产前检测的现状与前景

 

 

 

详见http://www.xinhuamed.com.cn/news/news-4482.html。

发育异常监控

孕妇怀孕过程中,可能会出现早产、流产、不足月以及胎儿发育异常等问题。这些临床指证的监控是可以通过NIPT来实现的。Stephen Quake团队近期的研究表示,胎儿游离RNA(cffRNA)的量可用于预测孕周和胎儿能否足月出生[44]。目前生物医学领域对早产、不足月、发育异常等问题研究仍缺乏基因组学等方面深入研究,因此对胎儿游离DNA、RNA、DNA甲基化等进行检测,可能可以逐步揭开相关发育异常问题的分子机制。对怀孕中的发育异常问题进行研究,有可能成为临床监控的一种技术应用,达到优生优育的目的。这方面可以成为NIPT厂家与临床科室合作的课题。

免疫排斥预警

怀孕过程中母体和胎儿之间的免疫排斥是妇产科重要的研究领域。孕妇和胎儿在免疫系统上的差异,如MHC相关基因的基因型等上的差异,可能会造成两者之间的免疫排斥。,而这些免疫排斥反应可能跟妊娠期高血压疾病例如子痫等的引发是相关的。在妊娠高血压疾病中,免疫适应不良学说一直是一个研究热点。通过NIPT技术对存在特定免疫排斥表型的胎儿和母体的免疫系统基因的基因型进行检测,可能可以得到相关的启示。

NIPT厂家可与临床科室进行这方面的科研合作,最终实现临床上对孕产妇进行免疫排斥预警的技术应用,为怀孕过程提供安全保障。

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